Pruebas de coronavirus: la tecnología CRISPR se establece para expandir las pruebas de virus

Si pudiéramos correr 2020 de regreso a su comienzo y recuperarnos, hay muy buenas posibilidades de que hagamos muchas cosas de manera diferente. Hay mucha culpa en torno a COVID-19, pero es seguro decir que uno de los mayores fracasos de todo este episodio fue la falta de pruebas baratas, rápidas y precisas en el SARS-CoV-2, el virus detrás de la pandemia actual. . No es por falta de información; finalmente, los científicos chinos publicaron la secuencia del genoma del virus muy temprano en la pandemia, e investigadores de todo el mundo hicieron lo mismo con toda la información que recopilaron del virus mientras se propagaba por todo el planeta.

Pero utilizar esa información en diagnósticos utilizables no fue un proceso sencillo. Inicialmente, el único método para detectar el virus era con pruebas de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), un proceso difícil que requiere técnicos capacitados y un laboratorio bien equipado, toma de días a semanas para dar resultados y solo se puede decir si el paciente tiene una infección actual. La prueba de anticuerpos tiene la opción de una prueba rápida y fácil, sin necesidad, pero solo se puede usar para ver si un paciente ha tenido una infección en el pasado.

Lo que se necesita mientras continúa la crisis de COVID-19 es una prueba con la especificidad y sensibilidad de la PCR combinada con la velocidad y simplicidad de una prueba de anticuerpos. Llega un nuevo análisis, basado en los últimos métodos de biología molecular y llamado “STOPCovid”, y podría jugar un papel importante en los diagnósticos ahora y en el futuro.

Inmunidad bacteriana

En la medida en que CRISPR ha entrado en el léxico popular, se entiende como una técnica nueva y poderosa para editar el genoma de organismos, quizás como una forma de tratar los trastornos genéticos. Sin duda, esa es una gran parte de la historia, y quién ganará con razón algún premio Nobel en los próximos 15 años, pero no cuenta toda la historia. Las raíces de los métodos de edición de genes CRISPR se encuentran en el mundo bacteriano y en cómo estos organismos unicelulares han desarrollado un sistema inmunológico sofisticado que se parece mucho al sistema inmunológico humano.

Con la cepa que evitamos, detectando y tratando las infecciones virales, a algunas personas les puede sorprender que haya miles de virus que han evolucionado para atacar a las bacterias. Se estima que estos bacteriófagos, o en pocas palabras, los fagos superan en número a sus huéspedes bacterianos por un factor de diez, lo que significa que la Tierra tiene algo así como 1030 partículas de fagos, un número que eclipsa enormemente a la población de cualquier organismo. Y al igual que cualquier otro virus, como la influenza o el SARS-CoV-2, el problema del fago es encontrar un huésped adecuado, inyectar su material genético y hacerse cargo de la maquinaria de la célula para multiplicarse aún más, generalmente destruyendo al huésped en el proceso. . .

Por tanto, es comprensible que las bacterias hayan desarrollado mecanismos para detectar y prevenir infecciones virales. Aquí es donde iteraciones de palíndromo corto agrupadas regularmente espaciadas, o CRISPR, comienza a reproducirse. Las secuencias CRISPR son esencialmente una colección de fragmentos de ADN que se han extraído del material genético de fagos invasores. Estas secuencias cortas, llamadas espaciadores, se agregan al genoma bacteriano por un conjunto de enzimas llamadas proteínas asociadas a CRISPER (Cas).

Los espaciadores son la clave para la inmunidad bacteriana. Junto con algunas de las secuencias repetidas adyacentes en el segmento CRISPR, los espacios se transcriben en fragmentos de ARN complementarios llamados crRNA o CRISPR-RNA. Los crRNA se unen a proteínas como Cas9, una enzima asociada con CRISPER, que puede desenrollar el ADN y cortarlo. La sección de crRNA del intermedio le permite unirse al ADN de pH del que proviene originalmente el intermedio, lo que indica a Cas9 que trunque el ADN de pH invasivo. Sin ADN de pH, sin infección, y tener el intermedio integrado en el genoma de la bacteria significa que ella y sus descendientes tienen un recuerdo de esa edad de pH en particular.

El descubrimiento de la importancia de CRISPR en la inmunidad bacteriana ha llevado naturalmente a métodos de ingeniería genética basados ​​en la enzima CRISPR-Cas que van mucho más allá de lo que se puede lograr con técnicas de biología molecular anteriores que se basan principalmente en la restricción endonuclear. Estas enzimas, que también forman parte del sistema inmunológico de las bacterias, evolucionaron para cortar el ADN en secuencias cortas de pares de bases específicas; hay cientos para elegir, pero está atrapado haciendo cortes en las nuevas secuencias que ocurren naturalmente o usando otras técnicas de ingeniería genética para insertar las secuencias donde las desee. CRISPR-Cas le permite dictar exactamente dónde se realizarán los cortes, independientemente de la secuencia.

Daño lateral

La increíble utilidad de las técnicas CRISPR ha llevado al descubrimiento de más enzimas Cas, cada una con propiedades diferentes. Una de estas enzimas, Cas13, tiene propiedades muy interesantes y útiles. Como Cas9, Cas13 usa krRNA transcrito de la región CRISPR como plantilla para reconocer fagos invasores. Pero en lugar de unirse y luego escindir el ADN, Cas13 se dirige al ARN del fago, escindiéndolo en la secuencia especificada por el intermedio en el ARNr. Una vez que eso sucede, Cas13 descuida un poco, escindiendo cualquier fragmento de ARN accesible, independientemente de la secuencia. Es un poco como cortar su número de cuenta de un extracto bancario, solo luego tomar todos esos pequeños papeles y pasarlos por un disyuntor, solo para estar seguro.

Este daño lateral inespecífico al ARN Cas13 conduce al desarrollo de un método CRISPR llamado SHERLOCK, para Desbloqueo específico de reportero de enzimas de alta sensibilidad. Desarrollado en 2017 en el laboratorio de Feng Zhang en el Instituto Broad del MIT, SHERLOCK usa pequeños fragmentos reporteros de ARN que han sido etiquetados en ambos extremos con diferentes marcadores. Después de un paso inicial de mejora del ARN, Cas13 encuentra y escinde su ARN objetivo. Una vez activado, escinde continuamente cualquier ARN que pueda encontrar, incluidos los fragmentos de ARN informador agregados a la reacción. Los dos signos en el indicador están separados entre sí por esta hendidura intermolecular lateral solo si la secuencia diana está presente, lo que permite a SHERLOCK detectar infecciones virales con una especificidad extrema y una sensibilidad delicada; en las pruebas de diagnóstico iniciales, el ADN del virus de pacientes con infecciones por el virus del Zika podría detectarse en el rango atómico, o alrededor de 2000 copias del virus por mililitro de muestra.

Sin embargo, a pesar de su utilidad, el procedimiento SHERLOCK sigue siendo un proceso de trabajo difícil. Como proceso de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, que actualmente es el estándar de oro para probar COVID-19, una prueba de diagnóstico basada en SHERLOCK requeriría técnicos capacitados y un laboratorio bien equipado para realizar, la posibilidad de contaminación cruzada como reacción múltiple. tubos. se accede, y aún se retrasaría debido al envío de muestras y la devolución de los resultados.

Para corregir estos problemas, el laboratorio de Zhang inventó una versión mucho más simple del análisis SHERLOCK llamada STOPCovid, porque Pruebas SHERLOCK en una sola olla. Optimizaron la mejora de ARN y los pasos de reconocimiento y escisión de Cas19 para que se ejecuten juntos en un tampón a una sola temperatura, lo que reduce el número de manipulaciones necesarias para cada muestra analizada. Esto reduce en gran medida el riesgo de errores de trabajo y hace que el proceso sea más fácil de realizar incluso en laboratorios mal equipados.

Laboratorio en madera

Esquema del proceso STOPCovid. Fuente: STOPCovid

Para mejorar aún más el proceso, los fragmentos informadores de ARN se rediseñaron para permitir la detección por anticuerpos. Esto puede parecer un paso en la dirección equivocada, porque como discutimos anteriormente, las pruebas de anticuerpos para la infección por COVID-19 solo pueden detectar si un paciente ha creado anticuerpos contra el virus SARS-CoV-2, y debido al tiempo que toma para o esto es más que un indicador tardío de infección. Pero en el análisis STOPCovid, los anticuerpos no se utilizan para detectar proteínas virales, sino como una forma de separar los marcadores de ARN escindidos que están marcados con dos proteínas diferentes. Esto abre la posibilidad de utilizar análisis de flujo lateral, donde la acción capilar arrastra una solución de reacción más allá de las rayas que tienen anticuerpos contra las proteínas marcadoras que se les aplican. Esto permitirá a los proveedores de atención médica utilizar una tira reactiva similar a una prueba de embarazo para leer los resultados del análisis STOPCovid, lo que convierte todo el proceso en una prueba de cuidado.

Como ocurre con cualquier cosa en el campo médico, hay un largo camino por recorrer entre el laboratorio y la clínica. Deben realizarse pruebas, deben resolverse las disputas de propiedad intelectual y los fabricantes deben estar alineados. Mientras tanto, sin embargo, el Dr. Zhang y sus colegas no están esperando. Pusieron el protocolo STOPCovid completo a disposición de todos, con todos los detalles sobre cómo lanzar la reacción e interpretar los resultados. Dejan muy claro que este tiempo no está dirigido al uso clínico, pero el mero hecho de que estén dispuestos a poner la información allí y cuidar los detalles después es bastante alentador.

Con la capacidad de detectar una infección actual similar mediante análisis de ácido nuclear combinada con la facilidad de uso de una prueba de anticuerpos secundarios, STOPCovid podría ser una verdadera revolución en las pruebas de virus, no solo para COVID-19 sino también para infecciones virales. venir.

  • ¿Transparente? dice:

    "... Suficientemente pronto ...."

    ¿Quiere decir que después dejaron de negar su existencia, encarcelaron / torturaron / desaparecieron a las personas que lo denunciaron, etc.?

    • José dice:

      Sí, La-Tecnologia es bastante malo para ocultar su inclinación a la fiesta, o tal vez simplemente no se molestan en tratar de ocultarlo más.

      Extraño cuando La-Tecnologia publicó artículos sobre hacks, no artículos sobre hacks.

    • cmholm dice:

      Dice la joya: "... muy pronto ...", traducido al 4 de febrero de 2020, en la forma del documento "Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 aislado BetaCoV / Wuhan / IPBCAMS-WH-01/2019, genoma completo ", https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MT019529.1. Dado un virus que aparentemente mutó en su forma amistosa en algún momento entre el 6 de octubre y el 11 de diciembre de 2019, independientemente de las patologías de la política de la República Popular China, "muy temprano" no me parece excesivamente "partidista".

Victoria Prieto
Victoria Prieto

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